乙烷有几种构象,Himastatin的全合成
Himastatin的全合成
文章出处：Kyan A. D’Angelo, Carly K. Schissel, Bradley L. Pentelute, Mohammad Movassaghi. Total synthesis of himastatin. Science 2022, 375, 894-899.
摘要：天然产物himastatin具有不同寻常的同型二聚体结构，这给合成带来了很大的挑战。作者报道了从容易获得的前体合成himastatin的简明的全合成，结合了最后阶段二聚化策略，该策略受到了对化合物生物成因的详细考虑的启发。将这种 *** 与模块合成相结合，可以方便地获得十几种设计好的himastatin衍生物，包括能够洞察其抗生素活性的合成探针。
耐多药致病菌的扩散被广泛认为是对全球健康的威胁。天然产品已经成为治疗细菌感染的新抗生素的主要灵感来源。(-)-Himastatin (化合物1)是从himastatin链霉菌中分离出来的具有同型二聚体结构的大环肽(图1)，具有抗生素和抗肿瘤活性。虽然(-)-himastatin (化合物1)的作用机制尚不清楚，但早期的一项研究表明，在磷脂和脂肪酸钠盐的存在下，其抗生素活性降低，从而推测(-)-himastatin (化合物1)可能针对细菌细胞膜。(-)-Himastatin (化合物1)的同型二聚体结构不类似于任何特征良好的抗生素类，包括已知的破坏膜的环肽。(-)-Himastatin (化合物1)最显著的结构特征是在最后的生物合成步骤中形成的环色氨酸残基之间的中心C5-C5'连接，这对观测到的革兰氏阳性抗生素活性至关重要。(-)-Himastatin (化合物1)后发现的相关单体天然产物，包括(-)-NW-G01 (化合物S2)，在化学酶的二聚作用下，抗生素活性显著增强。(-)-Himastatin (化合物1)的其它显著结构特征包括D-和L-氨基酸的交替序列，一个多肽连接，以及具有γ-羟基化作用的哌嗪酸残基。
Danishefsky里程碑式的合成(-)-himastatin (化合物1)，阐明了环色氨酸残基的Cα立体化学，其特征是早期的Stille偶联形成中心的C5-C5'连接，然后双向细化一个二聚环色氨酸。Yao和Ley课题组在相关自然产物(-)-chloptosin (化合物S1)的全合成中也表现出了该连锁的早期形成，他们发现交叉偶联 *** 获得更有吸引力的后期二聚体(也可获得异源二聚体衍生物)的 *** 并不成功。受其独特结构、合成挑战和抗生素活性的激励，作者开始对开发一种简洁的(-)-himastatin (化合物1)全合成 *** 感兴趣，这将为化学生物学研究提供快速的衍生物。
将(-)-himastatin (化合物1)二聚体结构的两个复杂片段结合在一起形成C5-C5'键，这是一个尚未解决的关键挑战，这鼓励作者考虑一种新的合成 *** 的发展。为了解决(-)-himastatin (化合物1)中的Csp2-Csp2的连接，作者需要确定一种不同于自身课题组之前基于还原或光解自由基生成和耦合的策略，以确保相似和不同片段之间的Csp3-Csp3和Csp3-Csp2的连接。作者首先详细研究了(-)-himastatin (化合物1)的生物合成，该合成来自线性肽(化合物4)的环化，然后通过三个细胞色素P450酶进行氧化剪裁。最后一步，在HmtS催化下，通过(+)-himastatin单体(化合物2)氧化二聚形成中心C5-C5'键。根据最近关于P450酶催化C-C键形成的理论研究，作者设想这种酶促二聚反应可能是通过两个环色氨酸自由基的自由基-自由基耦合发生的。这些自由基可能是在亚铁血红素活性位点通过吲哚林N-H氢原子抽离而快速连续生成的，然后在其附近发生结合。
作者设想一种受生物合成启发的化学 *** ，用于环色氨酸氧化二聚，可以遵循相同的自由基-自由基偶联蓝图。相对于氢原子的抽象，作者计划通过单电子氧化嵌入的苯胺亚结构来产生一个类似的开壳环色氨酸物种。与苯胺单电子氧化二聚反应的研究一致，作者预测得到的芳胺自由基阳离子会在最易接近的位置迅速二聚，形成所需的C5-C5'键。该化学的后期应用于(+)-himastatin单体(化合物2)的二聚化，使得线性的六缩酚酸肽(化合物5)直接进行模块组装为类似于天然前体化合物4的结构，不受简单二聚环色氨酸双向加工的限制。复杂肽大环的直接结合也为获得(-)-himastatin (化合物1)的异二聚体衍生物提供了难得的机会。
图1
作者的二聚化 *** 需要鉴定一种单电子氧化剂，该氧化剂可以靶向复杂的环色氨酸前体中的苯胺亚结构。已有的使用无机氧化剂生成苯胺自由基阳离子的先例，最终指导了作者对试剂的初步选择。作者发现，过量的六氟锑酸银(I) (5倍当量)，与1,2-二氯乙烷中的非亲核嘧啶碱TTBP结合，可以影响环色氨酸、环色胺和吲哚啉衍生物的C5-C5'二聚反应(图2A)。在每一种情况下，都分离出一个与对称的C5-C5'连接的同源二聚体一致的区域异构体。化合物二聚体二酮哌嗪(+)-7h的单晶X射线衍射验证了预期的连通性。使用含水的硫代 *** 钠还原工作对于更佳分离二聚体至关重要，因为由于在反应条件下它们对进一步氧化的敏感性，会消耗另一当量的氧化剂。作者发现，外配结构的二酮哌嗪(化合物6e和6g)分别在其对应的内衍生物(化合物6f和6h)的大约一半时间内被完全氧化。这一发现与化合物6e和6g中N1位点的可接近性增加有关，化合物6e和6g是初始氧化的位点。在吲哚啉(化合物6k)的情况下，甲基取代N1不会抑制二聚，这与自由基中间体相一致，而不是封闭壳层的arenium阳离子。作为优化工作的一部分，作者还研究了铜(II)盐作为单电子氧化剂的使用，以扩大可用于二聚法更复杂应用的试剂范围。化合物环色氨酸二聚体(-)-7a可由催化铜(II)三氟甲烷磺酸盐和(I)碳酸银(I)作为末端氧化剂得到，尽管产率较低(产率为34%，初始原料的回收率为18%)，而使用化学计量的AgSbF6的产率较高 (产率为54%，在0.50 mmol的规模下的产率为53%)。
为了研究这种C-C键形成二聚反应的机理，作者设计了一系列使用吲哚啉底物的实验(图2B)。当C2-甲基和C2-苯基吲哚，即化合物6i和6j的等摩尔混合物分别受到作者的二聚条件的影响时，作者观测到由相似的单电子氧化速率产生的同源二聚体和异质二聚体的统计混合物(图2B)。然而，同等比例的吲哚类化合物6j和6k的氧化二聚体主要(产率为90%)形成同型二聚体，并伴有少量(产率为4%)的异源二聚体(化合物7n)。当使用限制量的氧化剂时，作者确定这些吲哚林底物依次被消耗，N1-甲基吲哚林(化合物6k)在NH吲哚林(化合物6j)上选择性地二聚(图2B)。观测到较易氧化单体在类似亲核但较不易氧化的单体存在下的同二聚反应，作者得出结论，C5-C5'键的形成优先通过自由基-自由基耦合而不是亲核俘获发生。这一结论与环色氨酸(化合物6a)的同二聚反应中，尽管存在外亲核试剂(如甲基三甲基硅烷、二甲基烯酮硅基缩醛、N-三甲基硅林多林)，但没有形成加合物是一致的；先前的研究表明，苯胺基阳离子之间的自由基-自由基耦合速度快(PhNMe2?+二聚反应的k = ~107 M-1·s-1)。作者假设自由基在氧化剂表面附近的高局部浓度有利于它们直接结合而不是亲核途径。在作者的合成工作的背景下，自由基-自由基耦合流形对亲核干涉的快速和明显的不敏感预示着可将这种化学应用于复杂底物。这些发现强调了氧化二聚化 *** 和HmtS催化生物合成二聚化的机理之间可能存在的相似性，即自由基物种连续不断地在彼此接近的位置生成。
对于(+)-himastatin单体(化合物2)的合成，作者试图利用固相肽合成的实际优势，通过减少重复的纯化和分离步骤，提供快速和可定制的获取复杂肽的途径。与报道的(-)-himastatin (化合物1)中间体的基于溶液的合成 *** 相反，作者采用的是溶液-固相混合的合成策略。
图2
树脂结合的D-苏氨酸(化合物9，图3)由化合物L-亮氨酸(-)-10和化合物三联肽片段(+)-8组成，后者由缩酚酸肽模块(由商用羧酸三步制得)一步制得(产率为78%)，以及已知的Nε、O保护的D-5-羟基哌嗪酸(化合物S8，通过4-戊烯酸的九个步骤合成)。经裂解得到的粗产品化合物五缩酚酸肽(+)-11与化合物cyclotryptophan(-)-12 [由化合物色氨酸衍生物(-)-S3进行5步反应，产率为60%偶联，得到线性的化合物六缩酚酸肽(-)-13，总产率为64%。作者开发的高效混合的合成策略使中间体六缩酚酸肽(-)-13只需要一次色谱纯化就可以聚合组装，这优于线性液相合成，后者需要至少10个独立步骤才能获得类似复杂度的中间体。此外，作者的模块化策略允许在溶液中进行困难的耦合，并将色氨酸残基作为环色氨酸引入，以绕过后期氧化产生的立体选择性问题。末端去保护后，化合物线性肽(-)-13以49%的总产率环化为(+)-himastatin单体(化合物2，图3)，提供了(-)-himastatin (化合物1)的直接生物合成前体。1H和13C核磁共振(NMR)数据以及合成的(+)-himastatin单体(化合物2)的旋光度与文献值一致。
在研究了(+)-himastatin单体(化合物2)的合成后，作者重点应用生物合成启发的氧化二聚化 *** 来完成(-)-himastatin (化合物1)的全合成(图3)。虽然银(I)六氟锑酸盐和铜(II)三氟甲磺酸盐对简单的环色氨酸二聚反应有效(图2A)，但它们对更复杂的(+)-himastatin单体(化合物2)中包含的环色氨酸几乎没有氧化作用。作者假设，这些不溶性氧化剂的聚集和失活，以及复杂的大环肽底物较低的反应活性，可能是低产率的原因，作者试图通过评估其它单电子氧化剂来解决这一挑战。与这一假设一致，不溶性氧化剂，如其它Ag(I,II)和Cu(II)盐一般是无效的。然而，可溶性氧化剂，包括有机自由基阳离子，如魔蓝[(4-BrPh)3N?+ SbF6，确实提供了氧化作用，但产物是由肽主导的C-Br键(SNAr)亲核取代生成的。根据作者之前使用Cu(II)用于简单底物的二聚化，以及寻找具有良好溶解性和低亲核捕获倾向的氧化剂，作者确定了铜(II)六氟锑酸盐。作者将新制备及分离得到的Cu(SbF6)2通常用作可溶的Lewis酸催化剂，提供了一个机会来研究其作为化学计量氧化剂的用途。在实验中，(+)-himastatin单体(化合物2)暴露于1,2-二氯乙烷中过量的Cu(SbF6)2 (20倍当量)和DTBMP (4倍当量)中，(-)-himastatin (化合物1)的产率为40% (3 mg)，只有微量( 64 mg·ml-1)。除了TAMRA，来自其它荧光团的同型二聚体himastatin类似物也被发现是无活性的。与作者的预期一致的是，将himastatin结构的整体扰动最小化到只有二分之一的二聚体可能保留抗生素活性，作者发现TAMRA-异源二聚体(-)-25化合物(图4B)的MIC确实与(-)-himastatin (化合物1)在枯草芽孢杆菌中的MIC相当(6对1 mg·ml-1)。因此，作者的生物遗传学启发的晚期二聚体 *** 提供了异源二聚体形成的机会，这有助于获得荧光的himastatin探针，以及其它关键衍生物，包括通过化学酶法或双向合成难以制备的内消旋-himastatin。
其它特定于(-)-himastatin (化合物1)的结构特征包括一个缩酚酸肽连锁和5-羟基吡哌酸残基。评估了作者准备的用于研究这些特殊结构特征的衍生物，作者观测到，当酯键被二级酰胺(-)-15化合物或三级酰胺(-)-17化合物取代时，抗生素活性有下降的趋势，这与氢键位点的丢失一致。此外，当5-羟基吡嗪酸残基被脯氨酸残基取代时，抗生素活性完全被取消。虽然脯氨酸残基已被认为能诱导转化形成，特别是当邻近的氨基酸具有相反的立体化学性质时，它们不表现出像N-酰基哌嗪酸衍生物中所看到的那样明显的硬化效应。同型二聚体(-)-19和单体(+)-18化合物在23 oC的各种溶剂中的核磁谱图显示，在(-)-himastatin (化合物1)或其衍生物的光谱中没有观测到小的构象，这与脯氨酸取代后刚性损失的预测一致。综上所述，这些结果提供了由氢键和构象限制加强的结构刚性对himastatin的抗菌作用模式很重要的证据。
共聚焦显微镜已经被用于观测抗生素对枯草芽孢杆菌的生物效应，包括之一个批准的膜破坏脂肽，达托霉素。作者试图将合成的化合物与这种实验 *** 结合起来，进一步表征(-)-himastatin (化合物1)的抗生素活性。作者合成的异源二聚体探针化合物TAMRA-himastatin(-)-25，为直接观测其与细菌的相互作用和监测细胞定位提供了机会。当枯草芽孢杆菌细胞被8或16 mg·ml-1的TAMRA-himastatin(-)-25化合物溶液处理时，作者观测到细菌包膜中大量积累，在较低浓度时很少或没有细胞内染色。TAMRA-himastatin(-)-25化合物在低浓度下比高浓度下染色的细胞更多，但染色后可见膜缺损的细胞比例较小。染色最强烈的部位是在细菌间隔，除了斑沿侧壁染色。在较高的浓度下，膜挤压等缺陷与TAMRA-himastatin(-)-25化合物的侧向积累有关。这些弯曲的部位似乎反映了抗生素引起膜形态变化的区域。
TAMRA-himastatin(-)-25化合物的染色模式与未修饰的himastatin膜染色FM4-64相似。未处理的枯草芽孢杆菌细胞有光滑的细胞膜和正常的间隔环，但经亚致死浓度的任一组himastatin对映体处理的细胞显示出明显的膜缺陷，明显的膜增厚斑块。此外，观测到的himastatin对映体之间膜形态的相似性似乎与它们相似的抗生素活性相一致。在另一项实验中，作者评估了(-)-himastatin (化合物1)在致死浓度下对细菌作用的时间尺度。当(-)-himastatin (化合物1)以两倍于MIC值的浓度处理时，细菌膜在30分钟内被渗透，如活性染色剂SYTOX Green的内流所示。
尽管与himastatin缺乏结构上的相似性，但作者的显微镜观测结果与那些使用达托霉素的观测结果相当。未修饰的(-)-himastatin (化合物1)和作者的荧光himastatin衍生物(-)-25化合物在枯草芽孢杆菌中观测到的膜缺陷和定位模式分别与未修饰的和荧光形式的达托霉素相似。此外，使用himastatin治疗后膜渗透的短时间尺度，就像使用达托霉素治疗后所看到的那样，与基于物理扰动的作用模式一致。这种作用模式不同于某些其它革兰氏阳性肽抗生素，如万古霉素和泰斯巴汀，它们干扰细胞壁生物合成，杀死时间超过30分钟。另外，作者合成的一系列himastatin立体异构体的MIC值和细胞形态的相似性揭示了非手性相互作用(例如，与磷脂的疏水性基团)是观测到的抗生素活性的主要原因。总之，作者的化学生物学研究使用的合成探针提供了与(-)-himastatin (化合物1)的抗生素活性依赖于与细菌膜的相互作用的假设一致的发现。很明显，(-)-himastatin (化合物1)是已知膜破坏分子中的一个独特成员。
已发表的关于(-)-himastatin (化合物1)生物活性的临床前研究仅限于早期主要关注其抗肿瘤活性的报道。例如，研究发现腹腔注射(-)-himastatin (化合物1)可以延长接种白血病或黑素瘤细胞的小鼠的寿命，在评估的更高剂量下观测到毒性。在抗生素耐药性不断上升的背景下，作者的目标是继续详细研究和评估(-)-himastatin (化合物1)的抗生素活性，并在合理设计和合成具有改进特性的类似物方面的新见解的应用。
,全合成的英文multistriatin全合成